概述

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）是一類通過將細(xì)胞毒性小分子化合物共價(jià)連接至單克隆抗體而成的藥物，可增強(qiáng)傳統(tǒng)抗腫瘤小分子藥物的靶向性并降低毒副作用。由于ADC結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性及體內(nèi)藥物抗體比（DAR）的動(dòng)態(tài)變化，其生物分析面臨巨大挑戰(zhàn)。藥代動(dòng)力學(xué)（PK）是解讀藥物療效與安全性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其重要性不言而喻。另一大挑戰(zhàn)是抗治療藥物抗體（ATA）的評(píng)估，因其可能對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

生物分析的關(guān)鍵考量

●ADC的異質(zhì)性

ADC實(shí)為混合物：其抗體通過連接子與小分子藥物共價(jià)結(jié)合，可連接于抗體賴氨酸側(cè)鏈、鏈間二硫鍵還原產(chǎn)生的巰基，或抗體特定位點(diǎn)引入的工程化半胱氨酸1?3。

●體內(nèi)DAR值的動(dòng)態(tài)變化

ADC在血漿中理論上穩(wěn)定，但在特殊條件下連接子仍可能斷裂，導(dǎo)致小分子藥物解離。這種解離會(huì)改變DAR值或產(chǎn)生新的DAR分布。研究表明，ADC的清除率隨DAR值升高而增加?。

●待測(cè)物的選擇

小分子藥物與蛋白藥物的暴露-效應(yīng)關(guān)系（ER）可通過檢測(cè)原藥獲知。然而ADC同時(shí)包含抗體與小分子藥物組分，且體內(nèi)DAR值動(dòng)態(tài)變化、臨床數(shù)據(jù)有限，因此難以確定何種物質(zhì)影響ER。通常在ADC開發(fā)早期，會(huì)盡可能多地檢測(cè)各類物質(zhì)以全面了解其PK特征，一般包括：總抗體、ADC、游離小分子藥物。此外，ADC進(jìn)入體內(nèi)可能產(chǎn)生ATA，可能降低ADC療效，故需在開發(fā)中對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。

圖2. 抗體偶聯(lián)藥物的待測(cè)物類型。（Kaur, S. 等，2013）

DAR分析

DAR分析包含兩個(gè)層面：

1. 平均DAR：系統(tǒng)中毒素分子與抗體分子的摩爾濃度比；

2. DAR分布：不同DAR值的ADC在總ADC中的占比。  

常用方法：光譜法、高效液相色譜-紫外法（HPLC-UV）與質(zhì)譜法。

藥代動(dòng)力學(xué)分析方法

?總抗體的測(cè)定

• 間接ELISA：使用包被抗原捕獲總抗體，再根據(jù)抗體種屬屬性選擇二抗作為檢測(cè)抗體?。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用廣、技術(shù)成熟；缺點(diǎn)：有時(shí)難以獲得商用抗原。

• 電化學(xué)發(fā)光法（ECLA）：采用更高靈敏度、更寬動(dòng)態(tài)范圍的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)（如Meso Scale Diagnostics公司的MSD儀器）。

?偶聯(lián)抗體的測(cè)定

偶聯(lián)抗體指結(jié)合小分子藥物且DAR ≥ 1的抗體，多采用ELISA檢測(cè)。

• 橋連ELISA：基于生物素與親和素/鏈霉親和素結(jié)合的高特異性和信號(hào)放大效應(yīng)（一分子親和素可結(jié)合四分子生物素）設(shè)計(jì)，用于放大檢測(cè)信號(hào)。

?結(jié)合型小分子藥物的測(cè)定

通常先將ADC與游離小分子毒素分離，再通過化學(xué)反應(yīng)或酶解釋放小分子毒素，最終通過ELISA或LC-MS/MS準(zhǔn)確定量。

• ELISA：選用抗獨(dú)特型抗體、抗原胞外區(qū)（ECD）或抗人IgG抗體捕獲ADC的抗體部分，以抗小分子藥物抗體作為檢測(cè)試劑。

• LC-MS/MS：先用試劑（如蛋白A、抗獨(dú)特型抗體、抗原等）捕獲偶聯(lián)抗體，去除連接臂后，對(duì)小分子藥物進(jìn)行LC-MS/MS分析。

?游離小分子藥物的測(cè)定

指已從抗體上解離的藥物部分，可采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA?與LC-MS/MS?檢測(cè)。

• 競(jìng)爭(zhēng)ELISA（以游離DM1檢測(cè)為例）：樣品經(jīng)乙腈沉淀后，含游離DM1的上清與生物素化小鼠抗DM1抗體混合，轉(zhuǎn)移至包被BSA-DM1的酶標(biāo)板。樣品中DM1會(huì)與包被BSA-DM1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗DM1抗體——樣品中DM1濃度越高，BSA-DM1結(jié)合的抗DM1抗體越少，鏈霉親和素-HRP檢測(cè)的信號(hào)越低。

ATA分析

ADC的ATA結(jié)合表位可能是其三個(gè)組分（抗體、連接子、藥物）之一或其組合。ATA通常采用配體結(jié)合分析（LBA），捕獲試劑通常為固相ADC，理論上可捕獲靶向不同表位的所有ATA。分析一般分為兩步：

1. 篩選分析：初步檢測(cè)ATA；

2. 確證分析：驗(yàn)證免疫應(yīng)答的特異性。  

可使用的技術(shù)包括ELISA、橋連ELISA、ECLA、放射免疫沉淀法（RIP）、表面等離子共振（SPR）等，各方法均有優(yōu)缺點(diǎn)。

治療性單抗藥物監(jiān)測(cè)

Creative Diagnostics提供符合ISO 13485質(zhì)量管理體系開發(fā)的32種生物藥監(jiān)測(cè)ELISA試劑盒，由專家科學(xué)家按CLSI與FDA指南進(jìn)行質(zhì)控。

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